基于蛋白质组学分析骨疏康胶囊治疗骨质疏松模

0 引言 Introduction

骨质疏松症是一种以骨量丢失、骨组织的微小结构破坏，引起骨强度下降和骨脆性增加为特征的全身代谢性疾病，其临床表现以疼痛、脊柱弯曲为主[1]。骨质疏松症被传统医学认为属于“骨痿”“骨枯”等范畴。目前临床中医药治疗在辨证论治的指导下具有明显的疗效和优势[2-3]，能较好的改善西药治疗的药物不良反应及安全性问题。中药及中药复方有效活性成分众多，但部分化学成分尚不明确，且中药成分于复杂的机体内分泌及代谢环境中的作用机制尚不清楚[4]。随着蛋白质组学发展迅速以及生物信息学理论的建立，逐步解决了中药复方作用机制方面检测灵敏度不高、可靠评价指标少等问题[5]，并为中药复方治疗疾病的作用靶点研究提供了一个新的研究策略。

骨疏康胶囊是一种治疗骨质疏松症的中成药，其有服用方便、疗效稳定、不良反应小的特点[6]，已被临床广泛应用。已有研究表明骨疏康能减少骨质疏松症小鼠的骨细胞凋亡、提高骨密度和骨矿含量，能较好的调节骨质疏松症患者骨代谢水平[7-8]，改善临床症状。同时最近研究表明骨疏康可促进破骨细胞凋亡、抑制骨质疏松大鼠的骨吸收，从而延缓骨丢失和治疗骨质疏松症[9]。但目前骨疏康治疗骨质疏松症的具体机制及作用靶点尚不明确，且基于分子水平相关研究报道较少，故仍需深入探究。此次研究利用TMT(Tandem mass tag，TMT)标记联合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)技术研究骨疏康干预骨质疏松症大鼠腰椎的差异蛋白表达，运用生物信息学进行GO 及信号通路分析，预测骨疏康治疗骨质疏松症可能的作用靶点，进一步阐释其保护骨质疏松症大鼠骨代谢的作用机制。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018 年9 月至2019 年9 月分别于在福建省中医药科学院比较学中心和福建省中医药科学院基础研究所实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 36 只3 月龄清洁级雌性SD 大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005，合格证编号：2；在福建省中医药科学院比较医学实验中心继续饲养至6 月龄，实验许可证号：SYXK(闽) 2009-000。各组动物在温度20-22 ℃，适宜湿度和光照的环境中饲养。

1.3.2 实验药物、试剂与仪器 骨疏康胶囊(辽宁康辰药业有限公司，国药准字：Z)，主要成分：淫羊藿、熟地黄、骨碎补、黄芪、丹参、木耳、黄瓜籽；BCA 定量试剂盒(中国碧云天)；SDT 裂解液、TMT 标记试剂盒(美国Thermo Fisher 公司)；Discovery W 双能X 射线骨密度仪(变异系数1.0 CV%，精度0.25%，美国Hologic 公司)；Q-Exactive 质谱仪(美国Thermo Fisher 公司)；Easy nLC 色谱系统 (美国Thermo Scientific)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组、造模及给药 36 只6 月龄大鼠按照随机数字表法分成骨疏康组(n=12)、模型组(n=12)、假手术组(n=12)。根据文献方法施行大鼠双侧卵巢切除术建立骨质疏松症模型[9]；假手术组切除卵巢旁等体积的脂肪组织。术后3 d 肌注青霉素80 万单位/d。造模后，骨疏康组大鼠给予骨疏康灌胃[骨疏康换算后给药量为4.32 g/(kg·d)，用生理盐水配成药液]，1 次/d；假手术组和模型组每只给予等体积生理盐水，1 次/d，连续3 个月。各组给予普通饲料、自由饮水和活动。

1.4.2 取材 连续干预3 个月后，用2%戊巴比妥钠40 mg/kg注射麻醉处死各组大鼠，分离第1，2 腰椎，迅速放入液氮中；取左侧胫骨用于骨密度检测；选择大鼠腰椎用于提取蛋白，并将各组每4 只大鼠腰椎蛋白混合成1 个样品，即每组分为3 个蛋白样品用于检测。

实验动物造模过程的相关问题造模目的 探究骨疏康保护骨质疏松模型大鼠骨代谢的机制，对差异表达蛋白进行生物信息学分析动物来源及品系 3 月龄清洁级雌性SD 大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司模型与所研究疾病的关系利用TMT 标记联合液相色谱-串联质谱法技术研究骨疏康干预骨质疏松症大鼠腰椎的差异蛋白表达，运用生物信息学进行GO 及信号通路分析，预测骨疏康治疗骨质疏松症可能的作用靶点造模技术描述 参考文献[9]的方法，施行大鼠双侧卵巢切除术建立骨质疏松症模型动物数量及分组方法 36 只6 月龄大鼠按照随机数字表法分成骨疏康组、模型组、假手术组，每组12 只造模后实验观察指标 ①差异表达蛋白；②GO 功能富集分析；③信号通路分析；④蛋白质相互作用网络分析造模后动物处理 骨疏康干预12 周后，麻醉下处死各组大鼠，分离第1，2腰椎，迅速放入液氮中，用于提取蛋白；取左侧胫骨用于骨密度检测伦理委员会批准 实验方案经福建省中医药科学院动物实验伦理委员会批准

文章来源：《现代中医药》 网址: http://www.xdzyyzz.cn/qikandaodu/2021/0616/1187.html